聚合酶链反应的常见问题分析与解决方法:MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。模板量过多。质粒DNA的用量应<50 ng,而基因组DNA则应<200 ng。引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。循环次数过多;增加模板量减少循环次数至30,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的PCR循环。退火温度过低。电泳体系有问题:凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大;凝胶没有凝固好;琼脂糖质量差。若为PCR试剂盒则可能:由于运输储存不当引起试剂盒失效;试剂盒本身质量有问题,如引物选择、循环参数等选择不当。降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。聚合酶链式反应的引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%。徐州微量PCR检测技术服务
聚合酶链式反应的常见问题:出现非特异性扩增带:PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。徐州微量PCR检测技术服务聚合酶链式反应PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。
聚合酶链反应注意事项:在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂;为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照;内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差;PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定;防止DNA的污染: 采用DNA酶处理RNA; 在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。
聚合酶链反应:等位基因特异性聚合酶链反应:基于单核苷酸变异的诊断或克隆技术(snv不要与 SNPs 混淆)(患者的单碱基差异)。它需要事先知道DNA序列,包括等位基因之间的差异,并使用3’端包含SNV的引物(通常包含SNV周围的碱基对缓冲液)。在模板和引物不匹配的情况下,严格条件下的PCR扩增效率要低得多,因此用单核苷酸多态性特异性引物成功扩增表明序列中存在特异性单核苷酸多态性。有关更多信息,请参见单核苷酸多态性基因分型。装配聚合酶链反应或者聚合酶循环组件:通过对具有短重叠片段的长寡核苷酸池进行PCR来人工合成长DNA序列。寡核苷酸在有义和反义方向之间交替,重叠片段决定聚合酶链反应片段的顺序,从而选择性地产生很终的长DNA产物。聚合酶链式反应的引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶链式反应:反应的控制:PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子;镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5mmol/L;底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制,20~200umol/L;TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul);引物浓度一般为0.1 ~ 0.5umol/L;反应温度和循环次数;变性温度和时间 95℃,30s;退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃;延伸温度和时间 72℃,1min/kb(10kb内);Tm值=4(G+C) +2(A+T);循环次数 :一般为25 ~ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增加,出现了所谓的“平台期”。聚合酶链反应很容易理解和使用,并迅速产生结果。徐州微量PCR检测技术服务
嵌套聚合酶链反应的两组引物用于两个连续的PCR。徐州微量PCR检测技术服务
聚合酶链式反应准备:10×扩增缓冲液、4种dNTP混合物(终浓度)、引物(终浓度)、模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+(终浓度)、补加双蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量(或浓度)可根据实验调整,以上表格只提供大致参考值。PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即:引物(PCR引物为DN段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。引物有多种设计方法,由PCR在实验中的目的决定,但基本原则相同。徐州微量PCR检测技术服务
Real-time PCR从用途上分可以分为定性分析和定量分析:定量分析可以分为定量和相对定量两种。定量指的是我们想知道某个基因在初始样品中具体的拷贝数或浓度是多少?定量实验必须使用已知拷贝数的标准品,必须做标准曲线。而相对定量是指我们想知道某一个基因在不同样品中表达量的差异,其目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。举例来说,如研究项目中包括使用高盐胁迫处理的样本和未高盐胁迫处理的样本,记为已处理样本和未处理样本,通常可以将未处理样本指定为基准,规定其目的基因浓度为100%,用已处理样本的定量结果除以未处理样本的定量结果,就可以计算每个已处...