外泌体的提取、纯化和鉴定:每一个外泌体研究者较初都要为外泌体的分离提取而烦恼。选择的分离方式是利用超速离心的方式分离外泌体,并且可以选用梯度密度离心法得到纯度更高的外泌体。另外利用外泌体自身的物理化学性质所研发的各种市售的外泌体分离提取试剂盒也能达到分离效果。提取的外泌体的鉴定方式主要是通过形态学(电子显微镜技术)、粒子大小以及标志蛋白等方式实现的。近来的研究发现外泌体在比较多生理病理上起着重要的作用,如免疫中抗原呈递、瘤子的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能,可作为疾病诊断的生物标志物。外泌体具有脂质双层膜结构,能比较好的保护其包被的物质,且能靶向特定细胞或组织,因此是一种比较好靶向给药系统。腹水外泌体融合实验外泌体的膜蛋白有可能与细胞膜蛋白作用,活跃细胞内通路。外泌体的细胞源:人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体。calnexin蛋白 外泌体
全转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA,主要为mRNA和lncRNA、circRNA等非编码RNA。外泌体中携带有来自母本细胞的多种蛋白质、脂类、短链RNA和长链RNA等重要信息。对外泌体中的长链RNA进行全转录组测序及分析,不只能够筛选外泌体携带的特异Biomarker,同时对深入了解疾病或不同发育阶段的内在机制也有重要意义。外泌体全转录组测序体系,充分结合了微量核酸建库技术、NGS技术和全新的生物信息序列比对算法,可实现对1mL血浆中的外泌体即可进行mRNA、lncRNA和circRNA等RNAs充分测序,获取周全的外泌体转录组信息。外泌体有几种型号外泌体可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送。
ELISA与WB的原理一样,在抗体包被的微孔板中加入待测样品、封闭、一抗孵育,洗涤后加入酶标待测物形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,彻底洗涤后加显色剂并用酶标仪测定吸光值,结尾用标准曲线计算外泌体表达量。ELISA能实现对外泌体特异性蛋白的定量。其他外泌体鉴定方法还有微流体测定法和外泌体蛋白质组学分析等。由于外泌体在各种生命过程中的重要作用及其作为疾病生物标志物和药物输送系统的潜力,人们对此领域的兴趣越来越高。尽管目前在技术上取得了长足的进步,但尚未建立对外泌体进行准确和标准化鉴定以及定量的方法,关于外泌体的量应由囊泡颗粒的数量、囊泡蛋白的量或囊泡数与蛋白之比来定义仍存在比较多争论。建立外泌体分离、表征以及效价测定的标准化方法将是外泌体作为诊断和诊疗用途之前需要解决的问题。
为什么超速离心提取外泌体看不到沉淀?答:这种问题通常有三种可能性,其一:使用的细胞上清或者血清量太低,从而造成了这样的结果。其二:使用了不透明的超速离心管,一般来说外泌体产量都比较小,所以凡是不透明的管子,基本都是比较难见到明显沉淀的,可以当做有沉淀,然后操作下去即可。其三:使用了角转。部分品牌离心机的角转管壁粘附性比较低,超离结束没多久沉淀就会滑落下去,所以请在离心结束时赶紧去收样。外泌体的角色:1、外泌体发挥功能并一定需要受体细胞摄入外泌体:外泌体的膜蛋白有可能与细胞膜蛋白作用,活跃细胞内通路。2、外泌体的角色之一:细胞-细胞通讯,比如抗原递呈。外泌体产生于细胞中的多泡体。
外泌体携带大量特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质,在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗瘤子免疫等生理过程,与多种疾病的发生和进程密切相关。由于外泌体的特殊结构和功能,使得它具有潜在的应用价值,一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标,另一方面也可以作为诊疗手段,未来有可能作为药物的天然载体用于临床诊疗。外泌体研究,应选用血浆还是血清?答:血清是血液凝固之后收集的液体,所以其中少了纤维蛋白原,凝血因子,以及多了比较多凝血产物。纤维蛋白原可转化为纤维蛋白,具有凝血功能。在凝血过程中血小板会分泌大量的外泌体,有研究发现血清中有接近50%的外泌体来自额外的分泌。免疫印迹或蛋白质印迹是分析外泌体较常用的方法之一,其原理是外泌体上特异性抗原与抗体结合。超速离心法,这是目前外泌体提取较常用的方法。外泌体质谱
尚未完全发现调节外泌体细胞结合的途径。calnexin蛋白 外泌体
外泌体发现于1986年,是一种直径约30~100nm的双层膜囊泡状结构小体,可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肉瘤细胞等主动分泌产生,普遍分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。外泌体携带大量特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质,在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肉瘤免疫等生理过程,与多种疾病的发生和进程密切相关。由于外泌体的特殊结构和功能,使得它具有潜在的应用价值,一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标,另一方面也可以作为诊疗手段,未来有可能作为药物的天然载体用于临床诊疗。calnexin蛋白 外泌体
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