羰花青染料***用作Di来标记细胞、细胞器、脂质体、病毒和脂蛋白。长链羰花青包括DiO(DiOC18(3))、DiI(DiIC18(3))、DiD(DiIC18(5))和DiR，以及二烷基氨基苯乙烯基染料DiA(4-Di-16-ASP)用于标记膜和其他疏水结构。DiIC16(3)具有比DiI(C18)更短的烷基取代基(C16)。它们在脂质环境中具有极高的消光系数、环境依赖性荧光和短的激发态寿命。它们在室温下是油状物，在水中发出微弱荧光，但当掺入膜中或与亲脂性生物分子结合时，它们发出高荧光且相当耐光。这些光学特性使它们成为细胞质膜染色的理想选择。一旦应用于细胞，这些染料就会在质膜内横向扩散，导致整个细胞染色[1]。DiO、DiI、DiD和DiR呈现出不同的绿色、橙色、红色和红外荧光，从而促进活细胞的多色成像和流式细胞术分析。DiO和DiI可分别与标准FITC和TRITC过滤器一起使用。其中DiI及其类似物是**常用的，因为它们通常表现出非常低的细胞毒性。此外，DiI***用于测定LDL和HDL等脂蛋白。亲脂性氨基苯乙烯基染料DiA也常用于神经元示踪[2]。Super Flour 系列在生物荧光领域已逐渐替代FITC,Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7等荧光染料。黑龙江荧光染料高分子
5(6)-FITC(Fluorescein5(6)-isothiocyanate)是一种胺活性衍生物的荧光染料，具有广泛的应用，作为抗体和其他探针标记，用荧光显微镜，流式细胞仪、免疫荧光方法如ELISA和Western印迹实验。荧光素衍生物具有高吸收率、优异的荧光量子产率和良好的水溶性，是流式细胞仪和免疫荧光中生物检测**常用的荧光标记之一。**常用的荧光素包括用于标记蛋白质（特别是抗体）的异硫氰酸荧光素[5(6)-FITC)]，5-FITC和用于标记肽和寡核苷酸的羧基荧光素（5-FAM和5(6)-FAM）。BIOFOUNT提供***的基于荧光素的染料、底物和偶联物，以及一系列具有针对细胞标记和检测优化的特性的质量iFluor™荧光标记染料。福建郑州荧光染料PI是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。
一、体外生物发光试验荧光素试剂的制备：D-荧光素，钾盐，无菌纯水，完全培养基（自行配置）1、用无菌水制备100X荧光素原液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。2、将D-luciferin，potassiumsalt溶解于预热好的组织培养基中制备成浓度为150μg/ml的工作液。用组织培养基1∶100稀释储存液，配置工作液(终浓度150μg/mL)3、去除培养细胞的培养基图像分析前，向细胞培养板中添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析-注射器滤膜过滤除菌，0.2μm注：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。
SuperFluor活化酯（与Invitrogen的AlexaFluor活化酯完全相同）SuperFlour系列荧光探针，具有更强的荧光强度，更广的pH应用范围（pH4～10）,更好的抗淬灭性。在生物荧光领域已逐渐替代FITC,Cy3,Cy5,Cy5.5,Cy7等荧光染料。1．标记效率低——计算结果显示每摩尔145,000MW的蛋白标记的荧光团少于4mol有以下原因：1）缓冲液中含有痕量伯铵成分，与染料反应降低了标记效率。如果蛋白已经溶于含氨基的缓冲液（如Tris或氨基乙酸），标记前用PBS透析。2）蛋白含量较低(≤1mg/mL)会影响标记效率。3）标记步骤中加入碳酸氢钠的作用是将反应混合物的pH升高至～8，因为在弱碱性环境中标记反应的效率比较高。如果蛋白溶液的缓冲范围在低pH，加入重碳酸盐也无法将pH调节至**适水平。要么加大重碳酸盐的量，要么将缓冲液换成PBS，或用0.1M碳酸氢钠透析等。4）研究显示pH升至9.0～9.4，标记效率和标记速度（只需10min）明显改善。5）不同抗体与荧光团的反应速率不同，染料标记后保留的生物活性程度也不同，因此标准步骤也不是总有比较好的标记结果。为增加标记率，可以对同一样品进行再标记，或减少蛋白的量加大染料的量重新标记。有研究者在室温孵育1小时后再4℃孵育过夜，情况有所改善。染料DiI, DiO, DiD 和 DiR是一类亲脂性荧光染料家族，用于标记细胞膜和疏水性组织。
三、流式细胞仪分析1、取对数生长期的细胞，接种到孔板，过夜培养。2、如果要进行药物刺激，在细胞中加入感兴趣的药物进行干预，继续培养一定时间后，收集细胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重悬细胞，37℃避光孵育15min或更长时间。【注意】：由于细胞种类和实验体系不同，Rhodamine123工作液浓度和孵育时间可以根据预实验或参考文献自行调整。4、用流式细胞仪检测。
四、实验案例1、取对数生长期A549细胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培养基）,37℃培养箱培养4-24h待其贴壁，以便后续实验操作.2、弃掉培养液，PBS洗涤两次.3、用培养基（无血清）稀释Rh123母液制备1～20µMRh123工作液。具体工作浓度取决于细胞类型和细胞浓度。4、将Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分钟.5、去除Rh123工作液并用PBS洗涤三次细胞去除背景色.6、荧光显微镜观察. PI常用于细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)的检测，常用于流式细胞仪分析。黑龙江荧光染料高分子
Super Fluor 488（效果同Alexa Fluor 488）标记蛋白。黑龙江荧光染料高分子
异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）：FITC是应用*为***的一种荧光素，经激光激发后发出明亮的黄绿色荧光，*大发射波长为525nm。FITC的荧光强度受PH影响较大，常随着PH的降低而减弱，因此，在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。a)电泳分离后的蛋白质检测(b)蛋白质和肽的微测序分析(c)使用毛细管区带电泳进行分子分析(d)生物相互作用中的分子跟踪和检测(e)细胞和组织切片中的抗原检测(f)通过标记DNA片段进行细胞凋亡检测除了因其在水中的溶解性而易于用于偶联物制备外，异硫氰酸荧光素还具有明亮的荧光（由于偶联后的大消光系数和高量子产率），使其成为许多工艺的优先染料。在流式细胞术和免疫荧光显微术中，染料与各种抗体（一抗或二抗）结合，以检查和研究IL-17免疫缺陷和CD63在肾功能中的作用等状态。作为荧光素的衍生物，异硫氰酸荧光素含有一个异硫氰酸酯反应基团，这有助于其对通常存在于生物分子中的动漫和巯基基团具有反应性。黑龙江荧光染料高分子
