使用Genovis的OpeRATOR图谱O-聚糖位点对依那西普进行LC-MS分析：依那西普是一种 Fc 融合蛋白，具有高度 O-糖基化的铰链区域。将依那西普与OpeRAT一起孵育，并使用LC-MS/MS分析所得糖肽。促红xibao生成素 （EPO） 是一种具有单个 O-糖基化位点的 ~30 kDa 糖蛋白。在PNGase F去除N-糖并使用SialEXO进行去唾液酸化后，用OpeRAT消化天然蛋白，并通过反相LC-MS分析所得蛋白质片段。O-糖基化的位点可以通过识别OeRATOR消化位点直接推断出来。为了获得良好性能，需要去除唾液酸助剂，因此购买中包括2000个单位（如果SialEXO冻干）。1. 用于方法开发的灵活产品形式；2. 可以结合酶以提高效率；3. 适用于自动化工作流程；4. 即用型 - 只需加水即可。O-聚糖是OpeRATOR活性所必需的，而该酶在N-聚糖上没有活性。OpeRATOR和SialEXO处理后，O-糖基化蛋白被消化成携带O-聚糖的肽。消化发生在O-糖基化位点的N端。PNGase F 以冻干粉的形式提供，装在 1000 或 5 x 1000 单位小瓶中，分别用于消化 1 mg 或 5 x 1 mg 糖蛋白。上海N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶蛋白质组学研究
使用Genovis的GalNAcEXO 对 O-糖基化生物制药进行 Tn 抗原表征：未成熟的截短O-聚糖导致了复杂生物制药的异质性，使其分析更具挑战性。 O-聚糖的he心由n-α-GalNAc残基组成，通过糖苷键与丝氨酸或苏氨酸连接，称为Tn抗原。 现在，使用GalNAcEXO可以采用合适的酶策略来去除这些GalNAc并简化生物制药的表征。在质谱图中可以观察到重复峰的模式。其次，在与GalNAcEXO酶孵育后，剩余的GalNAc残基被完全去除，留下一个峰。因此，该工作流程确认了 O-糖基化生物制药上存在 Tn 抗原，并允许定量he心 GalNAc 水平。这种工作流程的另一个好处是减少了剩余的异质性，这有助于确认蛋白质的完整质量，并揭示截短的片段。上海N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶蛋白质组学研究OmniGLYZOR 水解 N-和粘蛋白型 O-聚糖。
我们测量了FucosEXO从一组dai表不同键的不同寡糖底物中释放的岩藻糖。FucosEXO可有效释放α1-2、α1-3和α1-4连接的岩藻糖，对α1-6连接的岩藻糖残基没有活Genovis的FucosEXO的底物特异性：岩藻糖以不同的键存在于N-和O-聚糖上。α1-2、α1-3 和 α1-4 连接的岩藻糖常见于 O-聚糖中，并作为 N-聚糖的天线岩藻糖基化，而 α1-6 连接的岩藻糖被发现是 N-聚糖he心的修饰。β1-3,4半乳糖的水解：Genovis的GalactEXO 是一种β-半乳糖苷酶混合物，可水解 N-和 O-糖基化蛋白中的 β1-3,4-连接末端半乳糖。
由于蛋白质的O-糖模式的异质性和O-糖结构的OpeRATOR特异性，形成了重叠的肽，从而可以获得O-糖位点的完整图谱为了进行比较，相同材料的标准胰蛋白酶消化物， 显示难以分析的少量且非常大的糖肽。使用Genovis的OpeRATOR进行O-糖位点定位：OpeRATOR 是一种 O-聚糖特异性蛋白酶，可消化丝氨酸和苏氨酸糖基化位点的粘蛋白型 O-糖蛋白 N 端。这会产生携带O-糖的糖肽，并能够使用质谱法进行O-糖分析、O-糖肽图谱以及中级分析。下面是OpeRATOR消解位点的示意图。ImpaRATOR 酶不会消化未修饰的丝氨酸或苏氨酸残基，也不会在糖蛋白的N-糖基化位点。
在Genovis的PNGaseF去除N-聚糖并用SialEXO和GalactEXO截断O-聚糖后，在质谱图中观察到几个与GalNAcs相关的峰。为了去除剩余的GalNAc残基，应用GalNAcEXO酶。用GalNAcEXO处理后观察到的单个蛋白峰显示完全去除剩余的GalNAcs。 GalNAcEXO在生理缓冲液和中性pH值中具有活性，使其与大多数样品相容。此外，GalNAcEXO的活性不依赖于任何可能影响LC-MS分析的辅因子，如BSA。根据底物的性质，糖蛋白的GalNAcEXO反应在2小时内完成，而更复杂的样品可能需要孵育过夜。Genovis的GalNAcEXO也可固定在离心柱中，以便快速方便地处理样品，在制备过程中不会残留酶。使用 GalactEXO 冻干和 GalactEXO 固定化都可以看到向 G0F 糖型的转变。上海N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶蛋白质组学研究
SialEXO在天然条件下水解糖蛋白，在pH值范围为6.5至9时显示出活性。上海N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶蛋白质组学研究
Genvis测试去除唾液酸以揭示电荷变体：唾液酸是带负电荷的糖残基，存在于 N- 和 O-连接的聚糖上。唾液酸的固有电荷可能会使分析工作流程复杂化，从而掩盖其他重要的修饰。Microspin 色谱柱可用于 2 x 0.5 mg、5 x 0.5 mg 或 10 x 0.5 mg 糖蛋白的去唾液酸化。1. 易于使用的离心柱；2. 提高酶与底物的比例，提高消化效率；3. 样品中不含酶。因此，唾液酸的去除有助于研究蛋白质中的潜在变体。该应用展示了一种快速简便的样品制备方法，可在电荷异构体分析之前去除所有唾液酸。上海N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶蛋白质组学研究
蛋白质的N-糖基化特征是一个关键的质量属性。它会影响生物制药的安全性和有效性，因此需要在开发和生产过...
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【详情】Genovis的PNGase F 是一种糖酰胺酶，可水解多肽天冬酰胺与所有哺乳动物天冬酰胺连接复合物...
【详情】Genovis的SialEXO产品是用于去除和分析唾液酸的唾液酸酶。这些酶对天然糖蛋白或游离的聚糖结...
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