GingisKHANIdeS蛋白酶蛋白组学

与IdeS不同，为了获得更均匀的度拉糖肽融合蛋白的消化产物，用Genovis的GlySERIAS固定化蛋白质消化该蛋白质，该蛋白由与琼脂糖珠共价偶联的GlySERIAS酶组成。通过将酶偶联到树脂上，可以增加酶与蛋白质的比率，从而可以进一步加速反应，以获得更完整的连接子消化。此外，该酶不会存在于样品制备中，可能会干扰样品分析。为了进行比较，度拉糖肽在37°C下用GlySERIAS固定化过夜，或用GlySERIAS冻干1小时并在37°C下过夜消化。 为了降低样品复杂性，使用内切糖苷酶GlycINATOR冻干去除Fc聚糖，并减少链间二硫键。通过反相LC-MS对样品的分析表明，GlySERIAS Immobilized几乎完全消化了Fc结构域中的连接子，留下了接近均质的Fc/2产物，其中含有来自连接子的一个丝氨酸残基。用 GlySERIAS 冻干 1 小时或过夜消化，两者都会产生几种 Fc 产物，并附着不同数量的丝氨酸和甘氨酸残基。GLP-1肽在所有三个样品中以两种变体存在。使用GlySERIAS固定化消化的均质Fc/2能够详细研究特定于Fc区域的质量属性。此外，在样品中未观察到干扰分析的酶峰。作为补充，Fc/2 产物在用 GlySERIAS 冻干消化后残留部分连接子，有助于研究位于 GS 连接子的修饰。Genovis的GlySERIAS可以对融合蛋白、多特异性抗体。GingisKHANIdeS蛋白酶蛋白组学

为了让所有实验室都能同时快速自动消化多种抗体，Genovis的FabRICATORMagIC的设计具有灵活性，适用于一系列自动化平台。我们在ThermoScientific™KingFisher™纯化系统上优化了FabRICATORMagIC的工作流程，但它可以转移到其他自动化平台，如果没有自动化，在振动台上也能同样出色地工作。消解后，将含有处理样品的深孔板直接转移到LC-MS的自动进样器中进行快速色谱分析，或转移到其他分析方法进行分析。FabRICATORMagIC与在消解缓冲液中添加0.05%聚山梨醇酯20兼容，以极大限度地减少自动化系统中可能发生的纯粹压力。使用KingFisher仪器处理样品时，样品制备非常简单。将样品、树脂和缓冲液移液到指定的孔或板中，然后将板放入仪器中。设计用于FabRICATORMagIC的BindIt™协议将控制每个步骤的孵育温度和时间。海南FabALACTICAIdeS蛋白酶IgG特异性蛋白酶消化在1小时内完成，且具有特异性。即使孵育时间延长，也没有过度消化的风险。

与IdeS不同，度拉糖肽由两个胰高xue糖素样肽-1 （GLP-1） 分子组成，它们通过柔性 GS 接头连接到人 IgG4 的 Fc 区域。为了分别研究肽和 Fc 区域，从而鉴定结构域特异性 PTM，用 Genovis的GlySERIAS 在 37°C 下冻干消化度拉糖肽 1 小时。为了降低样品复杂性，使用内切糖苷酶GlycINATOR Lyophilized去除Fc聚糖，并用DTT还原链间二硫键。反相LC-MS对样品的分析表明，使用GlySERIAS进行连接子消化后，肽从Fc区域完全去除。连接子中的大量甘氨酸残基为GlySERIAS提供了许多不同的潜在消化位点，这就是为什么Fc/2和GLP-1肽都被检测为几种变体，其中不同数量的甘氨酸和丝氨酸残基仍然连接。此外，还鉴定了GLP-1肽的氧化。尽管GlySERIAS同时在多个位点进行消化，但一式三份的酶解在获得的不同Fc/2变体的相对量中显示出可重复的结果。

蛋白酶用于生成肽，用于质谱分析蛋白质。这些应用包括蛋白质组学和生物制药的深度表征。由于遗漏了切割和样品制备诱导的伪影，传统的蛋白酶并不总是理想的，因此需要具有不同特异性的蛋白酶工具箱。Genovis的GingisREX 是一种精氨酸特异性蛋白酶，可将蛋白质 C 末端消化为精氨酸残基。与胰蛋白酶肽相比，所得肽更长，并可能导致序列覆盖率增加。质谱分析中蛋白酶的特异性对于获得高质量的数据集和避免复杂的数据解释至关重要。作为模型底物，使用胰岛素氧化β链来比较 GingisREX 和 ArgC 的酶特异性。胰岛素氧化β链含有一个精氨酸和一个赖氨酸残基。在RP-HPLC和质谱法上分析GingisREX和ArgC的酶切肽。GingisREX在赖氨酸残基上没有酶活性或其他额外活性，即使在长时间孵育过夜后，酶与底物的比例也很高（1：5）。然而，ArgC在精氨酸残基上显示出主要活性，但在赖氨酸残基上也可以看到酶消化。在酶与底物的比例为 1：20 和过夜孵育下，证明了 ArgC 的额外非特异性活性。在相同条件下，GingisREX未检测到这种情况。数据证实了GingisREX精氨酸残基的特异性活性，并显示使用Arg-C在赖氨酸和其他残基处的非特异性消化。Genovis亚基分析比肽图谱具有简单快速的巨大优势，更适用于高通量的检测，并可用于支持肽图分析。

不同于IdeS，Genovis的FabDELLO 是一种蛋白酶，可在铰链上方的单个位点消化人 IgG1，在两小时内产生完整的 Fab 和 Fc 片段，无需还原条件。该酶对具有突变铰链区域的抗体（如 LALA 突变）具有活性，并启用中级 LC-MS 来表征具有突变铰链的抗体的关键质量属性。FabDELLO 在铰链上方的单个位点消化人 IgG1 （...KSCDK / THTCPPCP...），生成完整的 Fab 和 Fc 片段。FabDELLO 是一种赖氨酸特异性蛋白酶。单个消化位点是人 IgG1 的三维结构的结果，使这种赖氨酸暴露于酶中。如果去除N-聚糖，则Fc上暴露的赖氨酸处可能会出现额外的消化位点。FabDELLO在天然条件下具有活性，需要钙离子的存在。在37°C和pH 7-8.5下获得良好活性。FabDELLO 是从 Bdellovibrio 细菌克隆而来的，并在大肠杆菌中表达。该酶含有 His 标签，分子量为 32 kDa。Genovis已经测试了 PBS 和 150 mM 醋酸铵，并且也适用于FabRICATOR HPLC。江苏GlySERIASIdeS蛋白酶抗体酶切

可以用Genovis的GlySERIAS固定化酶（琼脂糖珠共价偶联）消化度拉糖肽。GingisKHANIdeS蛋白酶蛋白组学

与IdeS不同，Genovis的GlySERIAS是一种独特的酶，可消化柔性富含甘氨酸的融合蛋白连接子，例如Gly4Ser和GlyxSery（GS）以及聚甘氨酸（G）接头。该酶能够分离多功能融合蛋白的各个结构域，以促进表征并增加对这些分子的理解。融合蛋白的中级分析既可以降低整体样品的复杂性，又可以对翻译后修饰进行结构域特异性鉴定和监测。为了改善连接子的去除，Genovis建议使用GlySERIASImmobilized。对于连接子表征，我们推荐GlySERIAS冻干。具有柔性接头的独特酶消化融合蛋白；中级方法可降低融合蛋白表征的复杂性；复杂融合蛋白的可靠且可重复的消化。Genovis的GlySERIAS酶切由甘氨酸或甘氨酸和丝氨酸残基的重复序列组成的柔性连接子。该酶在天然反应条件下具有活性，能够对复杂的融合蛋白进行中级表征。连接子区域同时在多个位点被消化，导致先前连接的组分分离。活性发生在pH7.6下，孵育时间可以根据所需的产物而变化。GlySERIAS是从噬菌体K克隆而来的，在大肠杆菌中表达。该酶含有His标签，分子量为18kDa。GingisKHANIdeS蛋白酶蛋白组学