陕西热原检测技术升级

PyroSHENTEK^®热原检测试剂盒突破传统检测方法局限，不仅能检测革兰氏阴性菌来源的内毒素，还可准确识别革兰氏阳性菌（脂磷壁酸 LTA）、病毒、真菌等产生的非内毒素热原（NEP），契合热原检测 “全风险覆盖” 的法规需求。其定量限低至 0.025EU/mL，实验数据显示，对 Flagellin、LTA、Resiquimod、Poly-IC 等多种 NEP 均能有效检出，且加标回收率稳定在 50%-200% 合格范围（如贝伐珠单抗注射液中 LTA 加标回收率 66.8%、Zysoman 加标回收率 113%）。此外，试剂盒联合了国内相关机构完成室间验证，与传统家兔热原试验（RPT）桥接结果高度一致 —— 如人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）中 LPS 加标回收率 152.1%、人血白蛋白中 LPS 加标回收率 71.6%，检测数据科学性符合国际法规要求，助力企业无缝衔接中美欧等地申报标准。

MAT 法热原检测背景值偏高会干扰结果判读，需从试剂、操作两方面解决。试剂相关问题中，非特异性活化（如试剂含微量热原）会导致细胞异常分泌 IL-6，需选用低内毒素的试剂与耗材；检测试剂添加过多（如抗体浓度过高）会增加非特异性结合，需按说明书稀释试剂或降低推荐浓度。操作环节问题更多见：孔洗涤不充分会残留未结合抗体与酶，需按方案完成规定洗涤次数（如 3-5 次），确保洗涤液充分浸润孔底；洗涤缓冲液污染（如滋生微生物）会引入外源信号，需现配现用缓冲液；加终止液后读板延迟（超 10 分钟），会因黄色产物降解导致背景虚高，需加终止液后立即读板；底物孵育时见光会引发非特异性显色，需在避光环境下进行 TMB 孵育；孔板底部脏（如残留指纹、液体痕迹）会影响光吸收，需用无尘纸清洁孔板底部后再读板。通过以上措施，可有效降低背景值，确保检测信号的真实性，避免因背景干扰导致热原浓度误判。

MAT法热原检测特定标准品与传统细菌内毒素国家标准品存在本质差异，需明确区分以保障检测准确性。MAT 特定标准品为大肠杆菌（E.coli 0113:H10:K）菌株制备，经全国 5 家药品检验所（含中检院）用凝胶法、动态浊度法及动态显色法协作标定，溯源至国际标准品，可同时检测内毒素与非内毒素热原；而传统细菌内毒素国家标准品（如 9000EU 规格）源自大肠杆菌（E.coli O111:B4），只适用于内毒素检测，无法识别非内毒素热原。关键验证数据显示，用 MAT法检测 9000EU 内毒素标准品时，加标回收率不在 50%-200% 的合格范围，因此不能替代 MAT 特定标准品。值得注意的是，尽管 MAT 试剂盒用内毒素标准品绘制标曲，但经验证其可识别非内毒素热原—若样品中存在非内毒素热原（如革兰氏阳性菌的脂磷壁酸），会触发细胞阳性反应，有效避免漏检，这也是 MAT 法在热原防控中优于单一内毒素检测的关键优势。

MAT法热原检测中，获得标准 S 型标曲需通过显色时机控制与图形调整实现，确保标曲拟合准确。在显色时机控制上，加入 TMB 底物后，孔内颜色会逐渐变蓝，且随反应时间加深，当标准品浓度梯度呈现明显蓝色差异（如高浓度孔深蓝色、低浓度孔浅蓝色）时，即可加入终止液；若仪器含 600nm 波长，可在终止前检测高浓度标准品的 OD600nm 值，当达到 1.0 左右时终止，此时显色反应处于线性期，终止后颜色由蓝变黄，信号强度约增强 3 倍，易形成 S 型曲线。在图形调整上，若标曲拟合后未呈现明显 S 型，可通过调整坐标轴范围优化—如将纵轴（OD 值）范围设为 0-2.5，横轴（热原浓度）设为对数坐标，突出低浓度区的拐点与高浓度区的平台区，使曲线更接近 S 型。此外，标曲配制需确保浓度点单独配制（非连续稀释），避免高浓度标准品污染低浓度点，导致低浓度区信号异常升高，破坏 S 型曲线形态。通过以上方法，可有效提升 S 型标曲的成功率，保障热原定量的准确性。

热原检测技术自 20 世纪初问世以来，经历了 “动物试验→体外生化检测→细胞生物学检测” 的三次关键变革，每一次变革均推动检测效率、准确性与全面性的提升。20 世纪初至中期，热原检测方法只有家兔热原试验，通过观察家兔体温变化筛查热原，虽实现了广谱检测，但存在动物成本高、操作繁琐、灵敏度低、种属差异大等局限，难以满足制药行业快速发展需求。20 世纪 60 年代，鲎试验法（LAL 法）的发明开启了热原检测的 “体外生化时代”，利用鲎血变形细胞裂解物的凝血级联反应检测细菌内毒素，灵敏度提升至 ng 级，检测时间缩短至 1-2 小时，迅速成为制药行业常规质控方法；但该方法依赖鲎资源，易受 β- 葡聚糖干扰，且只能检测内毒素，无法覆盖非内毒素热原。21 世纪以来，重组技术与细胞生物学技术的发展推动热原检测进入 “全热原管控时代”：重组级联试剂（rCR）与重组 C 因子试剂（rFC）通过基因工程技术制备，摆脱对鲎资源的依赖，消除葡聚糖干扰，实现标准化生产；单核细胞活化反应测定（MAT）利用人源单核细胞检测全类型热原，填补非内毒素热原检测空白，且结果更贴近人体实际反应。

在 MAT 法热原检测中，PBMC（外周血单核细胞）与单核细胞系各有优劣，单核细胞系更适合标准化检测。PBMC 的优势在于免疫细胞成分丰富（含单核细胞、淋巴细胞等），对热原反应敏感，灵敏度相对较高；但局限同样明显 ——PBMC 需从不同供体获取，供体免疫状态差异会导致检测结果不稳定，且无法长期保存，难以建立标准化方法学。单核细胞系（如 HL-60、MM6、THP1）则克服了 PBMC 的局限：细胞来源稳定（可批量培养），TLR 受体表达覆盖主要亚型（如 HL-60 表达 TLR1-TLR9），对热原反应重复性好，更适合商业化试剂盒与法规检测。不同单核细胞系性能也有差异：MM6/IL-6 法检测限约 0.05EU/mL，THP1/TNF-α 法因 TNF-α 为一级免疫效应物检测限更低，但 TNF-α 稳定性差；HL-60/IL-6 法检测限与稳定性均优于前两者，成为主流选择。湖州申科生物MAT试剂盒选用 HL-60 细胞系，正是基于其优异的稳定性与热原响应适配多场景，确保不同批次检测结果一致。