在传统宽场显微镜中,来自标本不同纵深的光线都可投射到同一焦平面(感光元件)上,所以其成像是整个样品的重叠像,没有纵向分辨能力。单光子激光共聚焦显微镜用***有效滤除了杂散光,分辨率有了本质上的提高,拥有了对样品的特定焦平面精细成像的能力,可以进行三维成像、动态成像等。然而,***在滤除杂散光的同时也将大部分来自焦平面的荧光滤除了,只有很弱的荧光到达检测器。若要提高信号强度,需要加大激发光功率,这又会导致对活细胞的光毒性和荧光分子的光漂白增加。双光子显微镜比较大的优势来源于其双光子光源的非线性光学效应,与单光子共聚焦显微镜比较大的不同在于无须使用***限制光学散射,其具体优势如下。双光子显微镜明日之星--FemtoFiber ultra 920 ;国内荧光双光子显微镜的原理

双光子显微镜是结合了双光子激发技术和激光扫描共聚显微镜的一种新型荧光显微镜,其原理大致是这样的:
首先,让我们来看看什么是荧光显微镜。荧光显微镜是以紫外线为光源,照射被检物体上的荧光物质或是荧光染料,使其发出荧光。相比普通光学显微镜,荧光显微镜运用了波长更短的紫外线,再将可见光过滤掉,提高了分辨力率。而当被检物体过厚时,从不同深度发出的荧光都会打在物镜上,使观察到的像模糊、发虚,无法清楚的知道被检物体的结构。而激光扫描共聚显微镜就是在荧光显微镜的基础上,增加了激光扫描装置,从而解决了上述问题。
激光共聚扫描显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束经照明,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中的荧光物质受到刺激后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测***时先聚焦,然后被光探头收集,转化为信号输送到计算机进行处理。这个装置能让通过探测***的只有焦平面上发出的荧光,使成像更为清晰准确,同时通过改变物镜的焦距,能对不同焦平面进行扫描,通过计算机绘出普通显微镜无法观测的三维图像。 美国激光荧光双光子显微镜磷光寿命计数双光子显微镜已延伸到各个领域研究中,它能对样品进行三维观察;

从双光子到三光子科学家正在从双光子转向三光子显微镜。1996年,Chris Xu在康奈尔大学(Denk同导师实验室)读博期间发明了三光子显微镜,如果双光子吸收可行,那么三光子看起来也是自然的发展方向。
三光子成像使用更长的波长,大约在1.3和1.7微米,其成像深度也比双光子更深,目前记录约为2.2毫米,人类大脑皮层厚约4毫米。相比双光子显微镜,三光子还要求以较低重频使用更强和更短的激光脉冲,而传统的钛宝石激光器难以达到这些要求,但是对于掺镱光纤飞秒光参量放大器则非常容易,比如我们的Y-Fi光参量放大器(OPA)。
双光子显微镜
在各领域研究中已有许多成功实例;生物领域:贝尔实验室的Svoboda等人研究了大脑皮层神经元细胞内钙离子动力学情形。利用双光子显微镜观察到的现象证明了钙离子的增加依赖于肌体触发的钠离子作用电势。
信息领域:美国科学家Rentzepis提出了一种在现有二维光盘的基础上将数据储存扩展到三维空间。由于双光子激发具有作用精细体积小的特点,避免了层与层之间的互相干扰,较大地提高了数据储存密度。双光子显微镜已延伸到各个领域研究中,它能对样品进行三维观察,其基础双光子激发效应也具有极高的应用价值。我们可以相信,随着科技不断发展,其他技术的不断结合,双光子显微镜将得到更大的发展与更广的应用。 双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为光源;

双光子之源:飞秒激光双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主Maria Goeppert Mayer提出,30年后因为有了激光才得到实验验证,但是到Winfried Denk发明双光子显微镜又用了将近30年。
要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用,首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程,这要求极高的电场强度,而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小,脉宽越窄,双光子吸收效率越高。
对于衍射极限显微镜,聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关,所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析,能够以高重频(100 MHz)输出超短脉冲(100 fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势:只有焦平面处才能形成双光子吸收,而焦平面之外由于光强低无法被激发,所以双光子成像更清晰。 双光子显微镜在各领域研究中已有许多成功实例;国内ultima双光子显微镜商家电话
的优势来源于其双光子光源的非线性光学效应;国内荧光双光子显微镜的原理
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