在形成高阻抗封接后,记录实验结果之前,通常要根据实验的要求进行参数补偿,以期获得符合实际的结果。需要注意的是,应恰当设置放大器的带宽,例如10kHz,这样在电流监测端将观察不到超越此频带以外的无用信息。膜片钳实验难度大、技术要求高,要掌握有关技术和方法虽不是很困难的事,但要从一大批的实验数据中,经过处理和分析,得出有意义、有价值的结果和结论,就显得不那么容易,有许多需要注意和考虑的问题,包括减少噪音,避免电极前端的污染,提高封接成功率,具体实验过程中还需要考虑如何选取记录模式,为记录特定离子电流如何选择电极内、外液,如何选择阻断剂、激动剂,如何进行正确的数据采集等许多更为复杂的问题,还需在科研实践中不断地探索和解决。膜电位Vm由高输入阻抗的电压跟随器所测量。芬兰双电极膜片钳电生理技术

离子通道结构研究∶目前,绝大多数离子通道的一级结构得到了阐明但根本的还是要搞清楚各种离子通道的三维结构,在这方面,美国的二位科学家彼得·阿格雷和罗德里克'麦金农做出了一些开创性的工作,他们到用X光绕射方法得到了K离子通道的三维结构,二位因此获得2003年诺贝系化学奖。有关离子通道结构不是本 PPT的重点,可参考杨宝峰的<离子通道药理学>和Hill的<lonic Channels Of Excitable Membranes 》。对离子通道功能的研究,主要采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能,目前有如下两种技术:电压钳技术(Voltage Clamp),膜片钳(patch clamp)技术。德国单电极膜片钳高阻抗封接一些学者建立了组织切 片膜片钳技术(Slice patch),就能在哺乳动物脑片制备上做全细胞记录。

在大多数膜片钳实验,要求所有实验仪器及设备均具有良好的机械稳定性,以使微电极与细胞膜之间的相对运动尽可能小。防震工作台放置倒置显微镜和与之固定连接的微操纵器,其他设备置于台外。屏蔽罩由铜丝网制成,接地以防止周围环境的杂散电场对膜片钳放大器的探头电路的干扰。仪器设备架要靠近工作台,便于测量仪器与光学仪器配接。倒置显微镜是膜片钳实验系统的主要光学部件,它不仅具有较好的视觉效果,便于将玻璃电极与细胞的顶部接触,而且是借助移动物镜来实现聚焦,具有较好的机械稳定性。视频监视器主要是用来监视实验过程中的操作,特别是能将封接参数(如封接阻抗)与细胞的形态对应,以实现良好的封接。
Flip-Tip翻转技术、将一定密度的细胞悬液灌注在玻璃电极中,下降到电极前列的单个细胞通过在电极外施加负压可以与玻璃电极前列形成稳定的高阻封接,打破露在玻璃电极前列开口外的细胞膜就形成了全细胞记录模式。德国Flyion公司的Flyscreen8500系统采用的就是这一技术,其通量比较高为6,即一次可同时记录6个细胞。它的***特点是∶(1)仍然采用玻璃毛坯作为电极 (2)药物施加微量、快速。
SealChip技术;完全摒弃了玻璃电极,而是采用SealChip平面电极芯片一定密度的细胞悬液灌注在芯片上面,随机下降到芯片上约1-2μm的孔上并在自动负压的吸引下形成高阻封接,打破孔下面 的细胞膜形成全细胞记录模式。采用这一技术的美国Axon (MDS)公司的 PatchXpress 7000A系统是高通量全自动膜片钳技术的典范,是离子通道药物研发的**性工具,在国外实验室和制药厂***用于 hERG通道药理学的研究。其通量比较高为16,即一次可同时记录16个细胞同时,其药物施加微量、快速,不仅用于药物筛选,还大量用于离子通道的基础研究。 微电极的制备膜片钳电极是用外径为1-2mm的毛细玻璃管拉制成的。

1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时,记录到ACh启动的单通道离子电流,从而产生了膜片钳技术。1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50cmH2O的负压吸引,得到10-100GΩ的高阻封接(Giga-seal),明显降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进,引进了膜片游离技术和全细胞记录技术,从而使该技术更趋完善,具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。1983年10月,《Single-ChannelRecording》一书问世,奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出贡献,荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。全细胞膜片钳记录是应用较早,也是普遍的钳位技术。全自动膜片钳市场价
通过膜片钳放大器的控制键将微电极的连接电位(junction potentials)调至零位。芬兰双电极膜片钳电生理技术
电压钳的原理∶ 用两根前列直径 0.5um的电极插入细胞内,一根电极用作记录电极以记录跨膜电位,用另一根电极作为电流注入电极,以固定膜电位。从而实现固定膜电位的同时记录膜电流。电位记录电极引导的膜电位(Vm)输入电压钳放大器的负输入端,而人为控制的指令电位( Vc)输入正输入端,放大器的正负输入端子等电位,向正输入端子施加指令电位 (Vc)时,经过短路负端子可使膜片等电较,即Vm=Vc,从而达到电位钳制的目的,并可维持一定的时间。Vc的不同变化将导致Vm的变化, 从而引起细胞膜上电压依赖性离子通道的开放,通道开放引起的离子流反过来又引起Vm的变化,致使Vm≠Vc, Vc与Vm的任何差值都会导致放大器有电压输出,将相反极性的电流注入细胞,以使 Vc=Vm,注入电流的大小与跨膜离子流相等,但方向相反。因而注入的电流被认为是标本兴奋时的跨膜电流值(通道电流)。芬兰双电极膜片钳电生理技术
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