Helios血小板裂解液反复冻融

    本课题在体外分离、培养和鉴定人牙髓干细胞、牙周膜干细胞及根尖牙rutou干细胞的基础上，通过比较体内、外不同培养模式下，血小板裂解液对这三种牙源性干细胞增殖及分化的影响，以期找到PL应用于牙源性干细胞培养、诱导分化的较好方式，为研究相关机制及组织工程应用提供实验基础，同时为将来PL在临床zhiliao方面的应用提供新的思路。结果如下。1.牙髓干细胞、根尖牙rutou干细胞和牙周膜干细胞的分离、培养和鉴定使用酶消化法或组织块法分离获得人原代DPSCs、SCAP和PDLSCs，利用有限稀释法克隆化培养以纯化传代细胞；采用免疫细胞染色及流式细胞仪鉴定细胞STRO-1等表型，确定所获细胞的间充质干细胞属性。采用成脂诱导及成骨/成牙本质诱导验证细胞的多向分化能力。2.血小板裂解液的制备及相关培养体系的建立使用10人份机**小板，混合后利用冻融裂解法制得满足实验需要的血小板裂解液PL；将PL制成品以一定的体积浓度比加入普通培养基及矿化诱导培养基配制成条件培养液；将扩增培养所获的牙源性干细胞以平面培养或复合HA-TCP支架培养，营造不同的细胞培养空间环境。

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本发明公开了一种制备血小板裂解液的方法及其应用,制备血小板裂解液的方法其包括以下步骤:将浓缩血小板在8001000rpm的离心机下离心处理1525min,离心处理后上层为富含血小板血浆,底层为红细胞层,将底层红细胞层分离出;将上层的富含血小板血浆成批地充分混合均匀,采用反复冻融发充分裂解血小板;去除细胞碎片,得到很终的血小板裂解液.本发明还提供一种细胞培养方法,其采用上述方法所制得的血小板裂解液培养细胞.通过本发明的方法可将浓缩血小板中提取的血小板的裂解液率提高至95%,缩短了操作的时间,且可使用临床过期产品重复开发利用.1.一种制备血小板裂解液的方法，其特征在于包括以下步骤：将浓缩血小板在800-1000rpm的离心机下离心处理15-25min，离心处理后上层为富含血小板血浆，底层为红细胞层，将底层红细胞层分离出；将上层的富含血小板血浆成批地充分混合均匀，采用反复冻融发充分裂解血小板；去除细胞碎片，得到很终的血小板裂解液。 Mill Creek血小板裂解液COA血小板裂解液用于无血清分离和传代培养脐带间充质干细胞的方法。

本研究中使用的HPL是Stemulate公司两款人源血小板裂解液（NH和H)是在工业规模(很小批量为20L)生产的，具备高度的批间一致性。将脂肪来源的间充质干细胞在DME/F-12中添加10%Stemulate-NH或10%FBS进行传代培养11代。在DME/F-12中分别添加5、7.5或10%Stemulate-NH，并与10%胎牛血清进行比较。羊膜来源间充质干细胞也在2.5或5%Stemulate中培养，与10%胎牛血清相比。牙髓来源的骨髓间充质干细胞在DME/F-12中添加不同浓度的Stemulate-NH或Stemulate-H，并与添加10%FBS的培养基进行比较。在所有实验中，每天都监测细胞，每次传代结束时，收获细胞，并使用台盼蓝和一个自动细胞计数器计数然后继续传代。

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