转染的注意事项:细胞铺板密度用于转染的较佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。一般转染时,贴壁细胞密度为70%-90%,悬浮细胞密度为2×106-4×106细胞/ml时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。因为转染效率对细胞密度很敏感,所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。在三种不同密度进行细胞铺板的比较表明铺板密度较高的,CAT活性也较高。得到较高活性所需的LIPOFECTAMINE试剂的量也相应增加了。这些结果说明,对于转染相同量的DNA所需的较佳阳离子脂质体试剂的量会因细胞密度而异。脂质体可以和带负电荷的核酸结合后重新形成复合物。南京细胞高效转染试剂供应商
细胞转染方法:1.脂质体转染法阳离子脂质体表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用,将DNA分子包裹入内,形成DNA脂复合物,也能被表面带负电的细胞膜吸附,再通过融合或细胞内吞进入细胞。脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前实验室较方便的转染方法之一,其转染率较高,优于磷酸钙法。由于脂质体对细胞有一定的毒性,所以转染时间一般不超过24小时。常用细胞类型:cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等2.电穿孔转染法电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内,这种方法就是电穿孔。当遇到某些脂质体转染效率很低或几乎无法转入时建议用电穿孔法转染。一般情况下,高电场强度会杀死50%-70% 的细胞。现在针对细胞死亡开发出了一种电转保护剂,可以较大的降低细胞的死亡率,同时提高电穿孔转染效率。金华正规细胞高效转染试剂直销厂家*有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并较终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。
细胞转染的原理、操作步骤以及小技巧:脂质体转染操作步骤:(1)细胞培养:取6cm细胞皿,向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液,37℃ CO2培养密度至40%~60%,密度过大,转染后不利筛选细胞。(2) 转染液制备:在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液:用不含血清培养基稀释1ug 质粒DNA。B液:用不含血清培养基稀释2ul脂质体。分别将A液与B液轻弹混匀,静置5分钟。(3)吸取B液加入至A液中,轻弹混匀。室温中置10-15分钟。(4)转染准备:用1mL不含血清培养液漂洗两次,再加入4mL不含血清培养液。(5)转染:把A/B复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃温箱置6~24小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。(6)瞬时转染后,可在48h-72h细胞长满之后,提取细胞蛋白或者RNA,验证敲减/过表达效率。
影响转染试验的因素:1.转染试剂跟细胞系不匹配转染试剂跟细胞系也是讲究配合默契的,使用同一种试剂,不同细胞系转染效率通常不同。但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,通过这些资料可选择较适合实验设计的转染试剂。当然,较适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。因为有些细胞系是不稳定的,可能随着培养时间的改变,培养条件的不同,不同的选择压力,可能引起不同的克隆选择。因此就算是同一个细胞系,在不同条件下转染能力的差异可能会很大。操作简便,对细胞毒性小,转染效率高受到研究者们的青睐。
DNA细胞转染步骤:1.提前现在细胞铺板 提前现在将细胞种植在24孔板中,以转染时细胞密度在60%左右为宜。2.转染过程⑴将0.8μg的DNA用25μl无血清稀释液稀释,充分混匀,制成DNA稀释液。 注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。⑵将2μlEntransterTM-H4000用25μl无血清稀释液体稀释,充分混匀,制成EntransterTM-H4000稀释液。室温静置5分钟。⑶将EntransterTM-H4000稀释液分别加入到DNA稀释液中,充分混匀(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上),室温静置15分钟。转染复合物制备完成。⑷将转染复合物加入到含细胞和完全培养基的培养容器上,轻柔混匀。 注意:①对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。②完全培养基可加物品。大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释。南京细胞高效转染试剂供应商
有血清时的转染 血清一度曾被认为会降低转染效率。南京细胞高效转染试剂供应商
细胞电转染实验的几点建议:1. 电场强度要合适合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的较佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的较佳电场强度。2. 细胞状态要好用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2d)。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛,表面结构致密比稳定期的细胞差,电转后,细胞膜的恢复能力强,而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.南京细胞高效转染试剂供应商
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转染技术:国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便,对细胞毒性小,转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)的转染性能较佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚...